 On peut donc faire pour assurer à nos patients, à nos familles chez qui on suspecte donc une prédisposition donc dû à imitation de TP53, les meilleures, je dirais, circonstances diagnostiques. Alors, le contexte, il est relativement simple au départ parce que le gène TP53, c'est un petit gène qui, comme la plupart d'entre vous voulez ça, est localisé sur chromosome 17, qui est un petit gène avec en fait 11 exons, le premier non codant, je précise cela parce que c'est évidemment infiniment plus simple que des grands gènes ou des maladies avec des prédispositions hétérogènes comme Berset 1 et donc Berset 2. Donc je dirais que le point de départ est relativement, est relativement simple. Alors pendant donc des années, et donc ce qui a prévalu, on va dire, quasi jusqu'à les années 2015, c'est que lorsqu'on suspecte une prédisposition de type mutation TP53, donc syndrome de l'ifroménie, après avoir informé dans en consultation, dans les consultations qui se sont déployées sous l'égide de l'institution nationale du cancer sur toute la France, et quand je dis la France, ce n'est pas uniquement la métropole, et donc un clin d'œil pour ma grand-amie Odile Berra, qui représente la martinique, parce que d'abord, nous sommes dans une conception républicaine ici, et donc l'idée, c'est qu'on va proposer donc à ces patients un prélèvement, on va extraire l'ADN et donc on va faire une analyse, et très vite on a mis en place donc à Rouen, la recherche de deux types d'altérations, l'altération classique, c'est-à-dire une variation néclotédique, ce n'est pas limitation de type ponctuelle, et puis nous avons rapidement donc découvert qu'il y avait parfois ces fameux réarrangements génomiques, délétions et duplications, à côté desquelles on passait par le séquençage, et donc il faut qu'il y ait cette double analyse. Et puis, comme nous sommes sur des enjeux diagnostiques, c'est une obsession, mais systématiquement, on demande un deuxième prélèvement, parce que quelle que soit la qualité du laboratoire ou de la chaîne médicale, en commençant par la prise de sang d'un fermière, on peut avoir des erreurs, donc on demande systématiquement, alors je pense que les choses sont entrées, mais parfois, un centre de collègue nous demandait pourquoi on demande un deuxième prélèvement, c'est une exigence, et c'est une exigence européenne, on contrôle systématiquement sur un second prélèvement. Et donc, lorsque nous avions fait donc cela, on a aussi développé des analyses de type complémentaires, parce que à Rouen on a une technique de détection des rearrangements qu'on appelle la QMVSF, d'autres laboratoires utilisent des kits commerciaux correspondant à la NPA, qu'on a utilisés et qui donnent des bons résultats. Donc, premier message, c'est que lorsqu'on fait une analyse de NTP-53, c'est analyse exhaustive, l'ensemble, naturellement, des exons, y compris donc le premier exon de nos codants, et, deuxièmement, la recherche de réarrangements, à la fois donc de la région codante et également de la région promotrice. Et donc, le premier arrêt sur image, vous le donnez, c'était là où nous étions en 2015. Nous avions reçu donc par le biais de l'ensemble de nos consultations donc aux génétiques à travers la France, à peu près des demandes pour 1 730 familles. Je rends hommage à toute mon équipe, de médecins, de biologistes et techniques, parce que tous les dossiers sont staffés, comme dans tous les services, et il y a des priorités. Et en particulier, quand mes collègues, par exemple de Ligère, Sollerance-Rugère, ou un mes collègues qui prennent en charge des cancers du sein, qui ont besoin d'avoir le résultat très vite, et bien aujourd'hui, on met ce qu'on appelle des fast tracks, c'est-à-dire que ça nous est arrivé à rendre des résultats en une semaine, et à peu près à 12 semaines de délai, mais on rendra toujours le résultat en fonction, donc je dirais, du calendrier. Et donc, c'est vraiment au cas par cas, et donc je rends hommage aussi à la flexibilité de l'équipe, parce que ça, si vous voulez, c'est du travail d'adaptabilité. Et donc la situation où nous étions à peu près en 2015, c'est qu'on avait un taux de détection à peu près de 12%, mais c'est normal d'avoir un entonnoir assez large. Et donc, dans 12%, on identifiait donc des mutations, et on avait identifié, après, en faisant le conseil génétique adapté, environ 415 porteurs donc de variations. La distribution des atterrations, le type, rien de révolutionnaire. Pierre qui a piloté la base de l'IARC au niveau international avait retrouvé cette distribution qu'on retrouve dans les atterrations somatiques, et Pierre Laurent Puig, qui a la lecture des analyses au niveau tumorale, a également ce type d'expérience. C'est-à-dire qu'on va retrouver la majorité indiquée dans cet histogramme circulaire. Donc nous allons avoir majorité de ces mutations dites dominantes négatives, mais vous voyez que vous avez tout le spectre des atterrations, des mutations, donc des pissages qui vont nécessiter parfois des caractérisations, et c'est pour ça qu'on a la chance d'avoir une équipe d'épissages ici représentées par Alexandra Martins et donc parce qu'il me dira pour faire des tests des pissages qui s'est enrichi d'ailleurs de Claude Doudaillet qui nous a rejoint depuis lundi, qui est un grand spécialiste de la question. Les mutations nul, donc des mutations nonsenses, des mutations pertes de fonctions, et puis les réarrangements. Quand nous regardons la distribution topographique des mutations, elles sont distribuées au niveau de tous les exons, d'où la nécessité de faire un criblage complet. Et puis ce qui est important, c'est qu'on va avoir certaines variations qui touchent, comme vous le savez des acides aminés très récurrents, les codons 248, les codons 282, qui étaient déjà dans le premier papier de David lorsque le papier de Science fut publié. Et donc la nouveauté, c'est la découverte de la nécessité de faire, d'avoir des mutations en mosaïque et donc de pousser beaucoup plus loin, et donc de ne pas se contenter de ce que je viens de dire et c'est ce que je vais vous présenter puisque c'est une question ici de l'optimisation. Parce que c'est encore une fois un challenge. Alors on savait qu'il y avait probablement des mosaïques. Pourquoi ? Parce que vous voyez par exemple, ce cas que nous avions reçu de nos collaborateurs, ce petit garçon qui avait présenté un corticot sur Enalom. On fait l'analyse et lorsqu'on regardait rapidement, donc les séquensages, si vous avez une mutation vous avez le pic sauvage et le pic mutant qui ont la même éteinte. Et en fait, lorsque les analyses automatisées, les analyses visuelles ne permettaient pas d'avoir un contrôle de qualité pour parler d'immutation. Mais quand vous regardez, évidemment, on a regardé ça de façon très ribuleuse, vous voyez qu'il y a un petit pic qui apparaît. Et ça, ça veut dire, on se demandait s'il n'y avait pas dans quelques cellules la présence d'immutation. Et donc on a développé des analyses ciblées qu'on appelle les analyses de Primary Extension, très sensibles, et en fait, simplement, ce que vous visualisez ici, c'est la confirmation de l'immutation. Donc déjà, des résultats par une approche classique basée sur le séquensage sangueur nous montrait l'existence donc de mutation. Vous avez ici donc un autre exemple, avec ici donc cette petite fille qui avait présenté donc un méduloblastome et ce qui est là redoutable, c'est que regarder ici donc ce qu'on appelle son analyse, ce que vous avez, c'est clairement une mutation thérosicope, donc elle n'est pas mosaïque. Mais on pourrait partir, et quand on a fait l'analyse chez les parents, on ne trouvait pas de variation. Donc on pouvait penser que cette mutation elle était apparue en quelque sorte donc dans les spermatozoïdes ou bien les ovocytes. Et donc il n'y avait pas de risque et non seulement pour les frères et sœurs. Mais en fait quand on analysait le père, donc évidemment c'est facile à voir à post-série, mais on a vu qu'il y avait un petit fiffrelin. Et donc on a confirmé cela parce que le papa était lui-même une mosaïque, c'est-à-dire que lorsque le père était lui-même à l'état d'embryon, probablement dans l'ordre de sa mère une variation était apparue. Il n'était pas malade parce qu'elle était récente que dans quelques cellules et malheureusement dans ces cellules qui ont donné les gonades. Donc c'est très important parce que là il va falloir aussi prendre en charge donc les frères et sœurs. Donc ce système de mosaïque qui touche les gonades qu'on appelle les mosaïques gonadiques sont importants. Et donc on a décidé dans l'évolution des laboratoires que ça a été un chamboulement l'arrivée de ces technologies du séquençage de très haute nouvelle génération le next generation sequencing qui permet d'embrasser l'exome et le génome mais qu'on utilise dans nos laboratoires diagnostic pour analyser donc des gènes de façon donc extrêmement rapide et bien on a décidé d'utiliser cela parce que quand vous faites du séquençage vous allez non pas séquencer une fois mais vous allez séquencer 100 fois 200 fois, 300 fois et donc vous descendez à une véritable profondeur qui vous permet de détecter donc des fiffrelins. Et donc voici les exemples et cette fois-ci vous avez autrefois 2015 et aujourd'hui et donc lorsque on fait l'analyse par séquençage ceci peut paraître compliqué mais en fait c'est assez simple vous avez ici simplement des traits qui sont les intérêts des autres simplement envers dans un sens en bleu c'est dans l'autre sens et tout simplement on va regarder et on a une espèce de fenêtre d'accroche qui nous indique que dans certaines séquences lues donc là on a lu par exemple à environ 500 fois on a montré qu'une seule partie vous trouvez une variation qui correspond à une variation mutante et donc ça veut dire que là on a la visualisation d'un état de Moseille dans 17% donc manifestement des cellules biéliétiques on avait cette variation tout à l'heure dans les cancers du sein exemple cette jeune femme qui présente un cancer du sein bilatéral à l'âge de 27 ans et 34 ans le séquençage si vous regardez ici jamais on aurait rendu une mutation comme ça elle est analysée aujourd'hui en séquençage de nouvelle génération et là encore à peu près donc là c'est par hasard on est tombé sur une mutation stop de P53 c'est une mutation Moseille c'est-à-dire que cette dame c'est elle lorsqu'elle est à l'état d'embrillon que la variation donc est apparue voici un autre cas de cette petite fille qui avait présenté donc un corticoturénalome donc à l'âge de 3 ans et là encore on va retrouver donc ce type de variation en séquençage de nouvelle génération donc la synthèse qu'on avait publiée c'est qu'on a repris des patients qui n'avaient pas d'histoire familiale parce qu'une moseille c'est précipose qu'il n'y avait pas d'histoire familiale chez qui les mutations n'étaient pas donc détectables des techniques classiques et on les a toutes réanalysées avec une profondeur à au débit et en fait on s'est rendu compte qu'il y avait probablement donc là c'est les chiffres qu'on vous donne on est tombé sur 2 moseilles dans les corticoturénalomes 2 nouvelles moseilles dans l'étuverte vexicoroïde 2 moseilles chez les patients diandrodicinser du sein on a beaucoup plus aujourd'hui ça c'est ce qui est aujourd'hui donc publié en 2018 ce qu'il faut retenir c'est que probablement 10% des situations cliniques très évocatrices d'un centre de l'ifroménie c'est-à-dire les corticoturénalomes les tumeurs de vexicoroïde ou les cancers du centre très précoce sont le fait de mutations moseilles et c'est important pour nos laboratoires diagnostiques alors attention attention au piège c'est pas parce que je trouve une mutation qui paraît en moseille que c'est une vraie mutation moseille je m'explique parce qu'on a beaucoup de pièges que je vais illustrer et donc il faut qu'on ait des analyses complémentaires et c'est la raison pour laquelle lorsqu'on est en situation de moseille qu'on va demander au prescripteur si on peut récupérer le prélèvement tumorale si la personne a été opérée à vexine biopsie parce que dans le monde donc de p53 on sait que si la mutation p53 joue un rôle causal on va la retrouver donc ici dans la tumeur mais ce que l'on va voir c'est que ici vous avez une mutation qui est en moseille mais dans la tumeur en fait dans la tumeur la tumeur élimine l'aile sauvage c'est ce qu'on appelle la perdothéroségosie et ça c'est un argument parce que ça montre bien la causalité de la variation et d'autre part ça monte véritablement la réalité de la variation pourquoi je précise cela parce qu'on commence à voir dans des laboratoires la détection la majorité des laboratoires utilisés de séquençage au début donc de variations exemple on avait été sollicité par des collègues qui avaient pris en charge de cette femme qu'il y avait un cancer métastatique de l'ovaires ce n'est pas du tout le spectre de l'ifromini mais en mettant personnellement nous ne l'avions pas adalisé nos collègues avaient considéré qu'il fallait l'adaliser à la demande des prescripteurs et ils sont tombés sur un pourcentage suggérant par NGS l'existence du mutation mais je me permets de rappeler que les mutations peuvent être très présentes dans la tumeur et qu'en particulier dans le cas des carcinomes serodograse c'est 95% et en fait ce qui se passait était donc avait des métastases elle avait des cellules tumorales et ce qu'on visualisait ce n'était pas une mosaïque c'est-à-dire quelque chose qu'on avait depuis la naissance c'était en fait une mutation présente dans les cellules tumorales qui avaient été récupérées dans le courant circulatoire donc le premier piège c'est de prendre pour une mosaïque quelque chose qui n'a strictement rien à voir la deuxième chose et cela ça a été documenté par nos collègues en particulier anglais c'est qu'avec l'âge on peut avoir ce qu'on appelle des mutations qui apparaissent dans le tissu de la mosaïque et attention à la détection donc de variations a priori en mosaïque lorsqu'on a une varie en mosaïque on n'attend pas 70-75 ans pour avoir une expression clinique il faut être compte de l'âge et puis nous savons aussi qu'un patient sous-chimiotérapie peut avoir des mutations donc les règles d'or les règles d'or quand on trouve quelque chose en situation de mosaïque 1 toujours toujours toujours toujours considérer l'histoire clinique est-ce qu'on a une situation évocatrice dans le son de l'ifroménie est-ce qu'on a des traitements est-ce qu'on a des critiques 2 toujours toujours c'est pour ça qu'on vous demande et qu'on vous taroute un peu à récupérer d'autres prélèvements qu'il s'agisse par exemple de frottigigou de commuter un tissu mais si possible le tissu dont est parti donc la tumeur et puis rechercher donc la perte de l'inactivation et puis là où nous en sommes donc ça a été finalisé donc par l'équipe très récemment donc là les contrôles de qualité et on finalise ciblé sur p53 extrêmement profond et on on capture l'intégralité donc du gène tp53 de sa région promotrice de ses introns pour pas se focaliser sur la lecture des régions codantes parce qu'on sait qu'on aura par exemple des altérations cryptiques ou des altérations qui sont des types réarrangements et donc aujourd'hui on a la capacité maintenant d'avoir une couverture extrêmement élevée donc du locus tp53 ça cela ne vous parle pas mais c'est énormément de travail c'est donc toutes les scripts avec les modules informatiques qui ont été développés alors attention dans un contexte diagnostic c'est-à-dire avec des validations diagnostiques avec des séries de contrôle passé donc là ce sont nos ingénieurs bioinformaticiens qui participent à notre réunion diagnostique hebdomadaire et qui nous permettent en utilisant différents types de logiciels de détecter toutes les variations et donc voilà ce qui a été stabilisé très récemment avec des contrôles d'annotation parce que c'est un problème important donc aujourd'hui septembre 2018 les analyses tp53 doivent être complètes elles doivent embrasser le locus ce sont donc des altérations qui sont importantes parce qu'il faut qu'on soit en capacité de détecter non seulement l'imitation classique mais des réarrangements et l'analyse exonique ne permettra pas deuxièmement il faut être en capacité de détecter des altérations en mosaïque avec une profondeur il faut qu'on soit utile c'est-à-dire qu'il faut qu'on soit en capacité de rendre les résultats avant le début du traitement et qu'on soit en capacité de faire du fast-track et donc on a mis en place donc la possibilité d'avoir sur des séquenceurs assez rapides des passages rapides pour rendre au prescripteur avant l'initiation du traitement discuté en RCP l'existence au nom d'une mutation et donc là vous avez par exemple des exemples qui nous permettent aujourd'hui en un seul temps parce qu'avant on avait le Sanger et la QMPSF de détecter par exemple des réarrangements que l'on voit bien par une espèce d'effondrement en fait du nombre de lectures obtenues donc en séquenceurs alors je terminerai sur les 4 minutes sur le challenge qui est sans doute le message le plus important de ce topo le problème de la génétique et nous sommes sur une pente glissante aujourd'hui c'est pas de détecter l'imitation c'est de les interpréter et ça ça prend un temps considérable et il y a une tendance pour plein de raisons où les gens vont faire la cavalerie de l'eau donc analyser analyser mais interpréter de variations même quand on travaille sur un gène depuis 25 ans ça me prend 30 minutes pour un patient pourquoi ? parce que la révolution conceptuelle depuis 2015 depuis qu'on a accès à l'achelon du génome c'est que comme je vous l'ai dit dans mon topo introductif on est tous et toutes porteurs de variations et même nos collègues américains qui essaient juxtapoutistes au bon sens parfois donc du terme eh bien on avait publié cet éditorial pour dire qu'au sait aujourd'hui que des variations qu'on considère comme causales ne le sont pas d'où le quitre que certaines mutations qui peuvent être graves doivent être revues dans une certaine lumière cette image contrastée et c'est la raison pour laquelle nous avons une police internationale placée sous le collège américain donc de génomique qui classe les variations et donc quand on a un rendu de diagnostic c'est pas je détecte une variation elle est de quelle classe il y a cinq classes qui sont des classes évolutives avec les connaissances et les deux classes il y a un grade diagnostic c'est ce qu'on appelle les classes cinq pathogéniques et les classes quatre la clé pathogénique et c'est pas parce que je trouve un séverter c'est pas parce que je trouve une cysteine qui est remplacée une tyrosine que c'est forcément une mutation qui va signer l'existence d'une causalité alors voilà tout le travail qui est fait et comment on classe ce niveau international et tout le travail que l'on fait chaque fois qu'on confie un prélèvement premièrement est-ce que cette variation elle a déjà été rapportée au niveau d'une façon récurrent donc dans les tumeurs tout ça c'est des faisceaux d'arguments est-ce qu'on est sûr qu'elle n'est pas présente chez les contrôles et on a des bases de données internationales la base agnomadée qui inclut 120 000 sujets à travers la planète pour savoir si on la trouve si il y a des sujets contrôles ensuite on va avoir des arguments vraiment biochimiques est-ce qu'il est localisé dans un domaine qui est un domaine qui est véritablement fonctionnel est-ce que donc cette mutation eh bien va changer dans ce but chimique important est-ce qu'elle est est-ce qu'elle va alterer un acide aminé qui est conservé depuis la nuit des temps parce qu'effectivement jusqu'au ver plat parfois nos protéines sont conservées nos acides aminés sont conservées et si l'acide aminé a été toujours le même ça veut dire qu'il y a une pression d'harmonie de sélection et donc tout ça peut-être modélisé avec beaucoup d'algorithmes bioinformatiques qu'on utilise et on utilise dans le laboratoire au moins quatre logiciels qui vont intégrer ces deux paramètres on utilise des tests qui ont été répertoriés dans la base arc et nous utilisons lorsque la mutation n'est pas connue eh bien donc les tests fonctionnels et donc c'est pour ça qu'on rendra les classes 5 et les classes 4 et que parfois elle sera nécessaire d'avoir des prélèvements complémentaires pour documenter un effet de surdépissage ou bien un effet donc transcriptionnel donc je reviens à l'essai transcriptionnel et donc l'essai transcriptionnel à double intérêt je classe la l'altération et je dis si l'altération est donc on fait la prise de sang on immortalise les donc au niveau BV et donc comme cela prend du temps ceci est surtout important pour les autres familles qui présenteraient donc cette variation cette image vous l'avez vue et ce vers quoi je vous montrer c'est par exemple la distribution que nous avons avec des mutations connues mais quand nous avons des mutations qui n'ont jamais été identifiées et c'est ce qui vous est montré sur la partie droite est-ce que toutes ces variations signent un certain nombre d'hyphromies eh bien la réponse est non vous avez donc ces variations qui n'étaient pas caractérisées et vous allez voir que pour certaines variations en fait elles n'ont pas d'impact sur la protéine donc ce sont pas des variations causales donc il faut pas les rendre comme responsables dans l'ensemble de l'hyphromie puisque elles donnent une activité donc transcriptionnelle et vous voyez que quand vous regardez c'est pas parce qu'on l'a trouvé chez une femme qui a fait un cancer du 5 à 47 ans ou dans une tumor assez rare de l'hiver qu'elle est causale ce sont pas des mutations qui sont aujourd'hui considérées comme des mutations donc causales à l'inverse certaines mutations sont véritablement des mutations causales et puis d'autre part on va trouver des mutations avec des effets maths donc il y a tout un faisceau d'arguments c'est la raison pour laquelle en règle générale et on avait testé à la demande de nos collègues brésiliens cette variation parce que le test est extrêmement reproductif parce qu'on la retrouve dans des familles françaises et donc c'est la raison pour laquelle ceci n'est pas pour lire mais voici la taille de nos compte rendus aujourd'hui quand on fait un compte rendu comme vous le savez on dit on a identifié donc une mutation donc évidemment pour des raisons on va inscrire le nom de la patiente j'ai mis le nom du prescripteur et donc nous avons donc une mutation et là ce résultat est obtenu sur deux échantillons indépendants et donc on dit qu'on est sur une classe 5 et on décline toutes les interprétations qui permettent de classer donc le grand challenge c'est le domaine interprétatif donc je conclurai sur comment doit-on optimiser en 2018 premièrement la position que nous défendons et nous verrons si le temps attention il faut faire des analyses de p53 quand c'est justifié quand c'est approprié et même si on peut discuter des dossiers atypiques et que les choses peuvent être élargies séquenciennement il faut véritablement aujourd'hui donc respecter ces fameux critères je pense à ce jour nous avons 413 familles qui ont été identifiées cela représente entre 700 et 800 porteurs donc de mutations et comme l'a dit notre ami Maria Isabelle Achat ce que nous connaissons bien est qu'a fait une éditoriale récente dans le journal National Concert Institute elle a dit attention aux panels aux panels extensives tous ces panels sont en train de donner un énorme biais dans le risque et dans l'information donc je vous invite à dire cette éditoriale signée par l'ONH ce qui montre quelque chose qui montre bien qu'il faut être extrêmement prudent et puis il faut être en capacité de détecter tout type d'altération il faut être en capacité de rechercher des mutations moséiques il faut être en capacité de le faire avant l'initiation du traitement pour être utile pour les patients les familles et naturellement les prescripteurs et donc il faut assurer l'expertise de l'interprétation voilà je m'arrête là je vous remercie pour votre attention et on prendra 5 minutes de questions si vous voulez