 Good morning. I cannot found the, I cannot found the, okay. Good morning. Today we start with super resolution microscopy. Of course you will have next week. Ok, la última semana un profesor de la laboratoria de Stefán Gell le enseñará sobre el estado de microscopía, sobre el resuelto, el pan, y toda esta técnica. Por supuesto, no estoy esperado en este campo, pero intentaré hacer todo lo mejor. La idea es para capturar las bases y para estar preparados para la próxima semana para recibir más información más profunda sobre este tema. Ok, vamos a empezar a ver esta imagen sobre las escalas, las escalas en microscopía y cuesta técnica es capaz de resolver sus detalles. Como sabemos, el electrónico de microscopía puede alcanzar el límite inferior. También tenemos un paro del río, un paro del río, un paro del río y un paro del río. Esta es una técnica desarrollada por Stefán Gell también. Estimulación, emisión, depresión, esto es lo que me concentraré hoy. Y otras técnicas, aquí tenemos la microscopía de confusión. Puedes ver aquí los límites. La pregunta es, ¿por qué la resolución superesolución de microscopía si tenemos incluso el microscopía electrónico? El problema es que cuando quieres ver dentro de la célula, necesitas el límite de microscopía. No puedes usar el microscopía electrónico, no puedes ver ahí y incluso puedes matar los límites. Por eso es la resolución superesolución de microscopía para ver dentro de la célula. Veamos también esta foto sobre el tamaño de varios entidades biológicas y también sobre el límite de difracción. Y comenzando de nuevo con esta muy importante pregunta, sabemos que es el límite de resolución que el límite de microscopía puede alcanzar. Es imposible ir abajo, usando el límite más alto, el objetivo numérical, pero lo que la resolución superesolución de microscopía ha hecho es exactamente para romper este límite. ¿Cómo hacer eso? En este ejemplo tenemos aquí, por supuesto, el límite de resolución en el límite de microscopía. Por ejemplo, si tienes microtubes aquí, son moléculas dentro de microtubes, y necesitas resolver con el límite de microscopía, tendrás un montón de moléculas. En el microtubes de florescence, lo que normalmente haces es exigir el sample también con el objetivo de microtubes, con el límite que se mezcla muy bien con la absorción de la proteína de florescence verde o espací. Y luego obtienes las florescencias de este sample, coge estas florescencias y creas la imagen de este región. En este caso, tenemos florescencias de estas todas las moléculas. Tenemos todos juntos, recibimos esta información juntos y es imposible resolver solo moléculas aquí. No hay manera para eso. Vamos a concentrar aquí. Este es el problema, no es discernible, este es el molécula. Este es el skin, el fútbol, el proceso de florescencia. Tenemos la excitación B. La florescación tiene una relajación normal de nanosecond. Es una época muy corta, relajación. Y en este caso, vamos a mover más, y seleccionamos, este es el frío, seleccionamos este río y evitamos este río. Y ahora, ok, en este microscopio, este es el slide más importante, en este microscopio lo que hacemos es mantener estas moléculas y seleccionamos el río en el que queremos obtener las florescencias. ¿Cómo hacer eso? En este microscopio, dependiendo de la absorción de las florescencias verdes que tenemos ahí, con la luz verde, por ejemplo, con un segundo río, el rojo río, que en este caso, o usualmente, es rojo, rojo río, con un donut en el centro, seleccionamos el río de este donut usando un plato de fútbol, es un piso de glas variable que te permite controlar este río. Se selecciona aquí, por ejemplo, tres moléculas en este río, en el resto de la especie, silencio, porque produce, estimula estas moléculas para emitir. Y como tenemos la diferencia entre las florescencias, la relajación, el tiempo de florescencias y la visión estimulada es que hay un gran diferencia en el tiempo de relajación, también la dirección de propagación, como sabes, cuando producen la visión estimulada, la luz produciendo o la foto generada por la emisión estimulada tiene la misma dirección de esta foto, pero en la florescencia tenemos emisión en todas las direcciones. Esto significa que podemos separar este proceso en el tiempo y en el espacio. Entonces, aquí inundamos estas moléculas para emitir la emisión estimulada. Estas moléculas permanecen en el espacio externo y se relajan con este tiempo de relajación y emitirán la florescencia. Entonces, capturamos la florescencia de esta molécula y, por supuesto, podemos también reducir este río controlando la intensidad de este río. La intensidad de este río es controlada como puedes ver aquí. Esta es la probabilidad de florescencia, ok? Continuamos estas moléculas aquí en este río. Pero hay un nivel aquí de intensidad, este es el trejo de la intensidad. Después de lo que tenemos un número de florescencia para producir o silencio la resta de las moléculas. Hay un limitado aquí. Cuando vamos más allá este río la intensidad o el tamaño de este río es controlada pero esta intensidad. Ok? Esta es la posibilidad. Y con esto controlamos este río. Podemos seleccionar solo una molécula. Y esta es la principal razón para eso. Entonces esta ecuación tiene que modificar para estrés microscopía. Voy a mostrarles ahora la nueva ecuación que Stefan ha desarrollado pero cómo hacer la imagen de esta especie de tubos. Normalmente lo que puedes hacer es mover este estrés. Puedes mover este estrés aquí en el futuro estas moléculas o una molécula es emitiendo florescencia lo capturas las moléculas son silencias y luego moveras el estrés para la próxima molécula capturas la imagen de este río y obtienes la imagen completa de esta especie. Esta es la manera como en estrés microscopía puedes producir una muy buena imagen. Y ahora podemos ver aquí quiero mostrar un momento Ok Creo Ok Tengo que agregar esta ecuación pero no importa. Ahora en la ecuación para el límite de resolución tenemos un termo adicional tenemos el ratio de la intensidad este es el el estrés y la intensidad del límite necesitamos muchas fotos al mismo tiempo para producir o silencio las restas moléculas como puedes ver la resolución aumentará la intensidad del límite aquí es la inversión como digo seleccionamos esta intensidad seleccionamos el río de este límite de resolución y en este caso puedes detectar moléculas singelas puedes reportar 8 nm resolución creo que podemos bajar hasta 5 nm hay algunos reportes sobre 5 nm ok como digo moviendo este seleccionamos moléculas por moléculas y construimos una imagen del espací en este río vemos una molécula singela fluorescente es claro, ¿cómo está la microscopía? ¿una cuestión? ok veamos ahora el set experimental ¿cómo está la microscopía? y ¿cómo es el set experimental? ok es similar a lo que tenemos en la microscopía fluorescente tenemos el exitación en este caso el gringo, el objetivo de la microscopía tenemos aquí el sample el espací de nuevo tenemos aquí la cámara para capturar la imagen y además tenemos el set bing para producir la desplazación de estas moléculas excites este es la escena de lo que obtenemos ahí tenemos la desplazación de la estimulación que es un chifo en el gringo en relación a la fluorescente normal como dije antes podemos separar estos dos procesos no solo en el espacio pero también en el tiempo de diferentes tiempos de relajación ok ahora miramos una aplicación de la estética microscopía esta es una microscopía confortable como sabemos en la microscopía confortable esta es una molécula y esta es una molécula están emitiendo la luz en el mismo tiempo debido a eso no hay una resolución buena aquí pero en este caso cuando salimos de moléculas tomamos la fluorescente de esta molécula y así podemos tener una resolución muy muy alta en el nivel de moléculas singles esta es otra aplicación y una comparación entre una estética microscopía y una microscopía confortable aquí es más claro y ahora una aplicación específica en este caso esta es una molécula nuclear complexa y moléculas singles aquí en este embalado puedes ver aquí muy muy claro estos moléculas singles usando gelos fluorescente proteínas attachan gelos fluorescente proteínas a estas moléculas y pueden detectar fluorescencias en moléculas singles esta es otro ejemplo este es un papel publicado por Stefan Hel en la neuro-muscular junction podemos detectar también moléculas singles usando diferentes proteínas singles que antes no se podían detectar esto con un microscope confortable esta es una aplicación de un paso en neurofisiológica puedes ver aquí la hipocampal organotipa pueden ver esto en el tiempo real en 3D ahora es muy excelente aplicación en el brain looking at the cortical neurons expressing also by a gelos fluorescente proteins en el tiempo real they obtain very good image of this region you can see in youtube this video even in the Stefan Hel way page and this here is moving in real time and they are able to look they are the interaction between between this even molecules inside this cone now where is the problem with or the dropout of a state microscope the question is that you need a lot of photons to excite the sample you will have photo damage there photo bleaching of your sample you need in all the application of using biological samples you need to keep some limit in which you cannot damage the specimen and for that they develop another technique that is called resolve is again a state microscopy but what they did there is to use to use green fluorescent protein with two metastable levels two metastable levels as you can see here they have long living time the relaxation time is very long and gives you the possibility the possibility to use again state microscopy but as you have longer relaxation time you will produce this phenomena with lower intensity of the state beam you can silence the rest of the molecules and these molecules stay there in the region you select they are long time and then using this technique they reduce a lot this IS the threshold then using very very low power very low power state beam they are able to have the same results then there is not there photo damage photo bleaching you can combine both techniques in this case of course this this new kind of a green fluorescent protein gave the possibility of this new advance in a state microscopy but also it's possible to combine a state microscopy with confocal microscopy because when you need to go where in the sample you combine using a pinhole in the same setup and you can obtain image from all the specimen in depth combining state with confocal you select the best region in depth and with step you select there specific molecules this is another kind of technique that they develop ok now you can have a lot multiple poles there and the image you reduce even the time because normally in a state microscopy you use poles lasers to have high density of photons but these techniques allow you to have multiple pools without any kind of photodamage the problem is photodamage that you can have a lot of poles but without producing photodamage but now it's possible with this technique and this we have also some application this is now the the trezo now it's only some watts per square centimeter and before was a little bigger this quantity ok now a application you can this also you can look at this paper here in two hours scanning there is not any photodamage and this is very good ok now I will speak about another techniques total internal reflection fluorescent third microscope but before that I want to show some videos one video in which you will look at this phenomena because we know we need to know about total internal reflection and also about evanescent field maybe some of the students were not able to see and they know about this but I want to show for all because it's very basic concept that we will use here let me to show you this is the example Freddie sent me very nice to understand total internal reflection in total internal reflection we have for example a glass I reflected index and we have a there and we know that on the specific angle in this case here this right will be totally reflected there is a specific angle for a specific relation between these two media depending on the refractive index of the glass but normaly we have that not all the light is is reflected but at this border at the limit we have evanescent field there that in this review as we will see now in this very nice example see there we have there evanescent field and we can change we can change the depth of this field changing a little this angle we can change it and we will have there in this surface this evanescent field this is what we will apply for this kind of super resolution microscopy using total internal reflection even micromet depth there even nanometers controlling this angle then let's now we start with the applications this kind of super resolution techniques is very useful when you look at for example proteins in the membrane mainly because how these techniques work normally you add the microscope slide and the sample is there the membrane of the cell for example is in contact with this slide then controlling this angle you only produce fluorescence of these molecules that are very close to the surface because the evanescent field is already reaching this region and there is only 3 or 4 fluorescence there controlling this angle we will see how they do this experiment and we have now here very very nice very nice example of this application these are single molecules in the membrane of the cell and as we can see here to differentiate this using epi fluorescence microscope this is the idea but how to implement this technique ok now here some equation maybe you know or you will see this better in the anaconference this is the intensity of the evanescent field that we have in this region when we add when we add here the excitation beam we have this evanescent field here if you have a molecule here this molecule will receive enough light and will have fluorescence but this molecule here will be not excited then we have only fluorescence coming from the same region even there are some some examples in which they to test about this region they introduce there some diet and you can see looking at the fluorescence of this diet the depth of this penetrage and selecting the angle this is the top normally there are different kind of experimental setup you have the excitation beam from here you can use here a prism here that produce total internal reflection but you will have in this region the sample is here of course and in this region you produce the fluorescence of the molecules to the microscope slide there here again this is a microscope we have the objective we collect this fluorescence and produce an image here this is the one of the most useful kind of excitation but also we can use this setup we use a lens here that produce parallel beam of light in this region but to have total internal reflection we use this setup in which the excitation beam is coming not through the center of the lens it's coming here through this border and this will produce total internal reflection there and also evanescent field in this region ok and also moving this lens you can control this angle ok this is another kind of experimental setup there are many many different scheme here this are prism based total internal reflection configuration in this case we have this setup in which we have again the focusing lens but coming from the borders of the of the microscope objective in this case of course we control this angle moving this lens this lens are are set in a 4 ok using also here a prism is another kind of configuration and this is also another kind of a configuration this is the cover slip fix to this and fix to a prism ok this is the focusing lens the excitation beam coming from here and here internal reflection ok this is the object base without prism is another example we use object with high numerical aperture in this case again the beam coming from this side not at the center and in this way coming from the back focal plane why back focal plane if we have there we know that going a collimate beam we have a collimate beam in the back focal plane we get focusing we use this we focus here to have collimate beam because a good total internal reflection uniform for that we need a parallel beam of light ok and of course under this configuration control this angle of total internal reflection ok these are another configuration base on objective not prism of course there are some advantages some different using prism and objective depending on the specimen and so on a is better to use objective or prism depending on the penetration deep you will need there in your specific this is in this case we have the laser here again the objective here this is a using epi illuminator filter cube and in this in this another case we have another configuration there are different configuration this is also another kind of configuration here using laser optical fiber here but the idea is the same the idea is to control this angle you control the penetration depth the molecules that are only attached to the surface of the slide hey you can have there the sample in culture media water whatever you want because it's possible using this at all ok let's we look now at some application you can use laser also you can see here the difference between epi and total internal reflection microscopy you can look there you can differentiate single molecules at the surface of the microscope slide this technique is mainly used for detecting membranes so you can attach very very easily this membrane to the microscope slide ok let's we conclude here with this technique it's small random motion of organelle tower or any way from the membrane so membrane events we have exocytosis cytoskeletal dynamics we can study this process very easily so microscopic membrane folding and indentation also we can study kinetic rate of association dissociation at the membrane even in condition in continuous presence of fluorophore in bath as I say you it's very useful for membrane studies it's also useful in sulphate biochemistry single molecule fluorescent low background chemical kinetics and diffusion at the surface and so I think because this later I don't have more to teach for this because you will have next week of course the later of a professor coming from the Thefangel lab we will stop here maybe we can have some discussion to comments to expert also in this technique we can discuss I say you yesterday about this phase place we are speaking about this but also about the station of fluorescence how to differentiate between the fluorescence and the place of the molecules when you read when you read paper it will induce own experience but the difference is not so much in the state being at the fluorescence but there is and you can ok again ok yes come on because he said that they can not hear there ok come on here come on here yes ok we can use this use a microphone please I am not expert I don't see yes ok really to review you are helping me here because I am not expert on this I did my best but he is expert the idea is you at least to know the basics and you need to be visible to the recording people come on ok thank you I did not you will do now thank you I am not an expert but you have stayed by crossing currently I am I am currently visiting researcher at University of Amsterdam there is a research group is called Physics of Living System and the leaders are Erwin Peterman and Haas Voit I am there just for two months and at that University we are going to build a 3D a state microscopy and this microscope in this microscope there are many aberrations and if you if you can correct aberrations you get better resolution and today people try to correct this aberration by adaptive optics and it's I think I would say people may usually say knowledge edge or ok if you ask a specific question I hope to answer ok with the fluorescence beam and when the molecule is in an exited state you have to stimulate it with the step beam is that for produce a stimulated emissions the process to the laser beam has to have a specific synchronization for that to produce that phenomenon how do you do that with this phase plate is a common device or is a complex technology how is really this the main question there how to do that ok as you see in the lecture by Humberto you need to you need a intensity distribution for example in this example you need an intensity distribution that in the side it's dark and around it bright ok so if you have this intensity distribution by stimulated emission you depleted this area around the center and just allow the fluorescence beam to comes out from the inside ok so you need this intensity distribution and how to create this intensity distribution ok in optics phase is very important if you manipulate the phase of light you can create any intensity distribution as you want ok so an option is this that you have a trace back by some algorithms for example normally you can use this place it's a variable piece of glass exactly example using digital photography special line of light also that many made if it's just a device that can be built for example just consider lateral direction you need a circular disc for example a glass that phase phase change for example here to again the first point by 2 pi amount you consider a glass that has some coating just that when you start from the first point and around the circle the phase change continuously until 2 pi ok if you put this phase plate in front of parallel beam in the focus you see the do not shape this is for lateral direction and if you want to have the axial estet microscopy you need just a phase plate that there are a pi phase in the center and a pi phase in the center relative to around the center ok this 2 phase do your work yeah looking at looking at where the detector is I would like to know what kind of signal is the detector or transmission or reflected intensity detector from the moloco ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok Por ejemplo, APD, Avalanche Photodiode. Sí, sí, sí, sí, sí, sí, sí, sí, sí, sí, sí, sí, porque tienes un poco de fotos y con Avalanche Photodiode puedes amplificar y detectar muy bien. Muy bien. Para experimentar, estamos intentando construir el set-up y creo que cada set-up de opticales parece simple en un slide o en un blackboard. Pero, sí, pero, sí, lo que es muy importante es el alineamiento de estos dos beams porque si, si deberías overlapar estos beams muy precisamente en dirección lateral y dirección axial, o sea, el beam de excitación y el beam de excitación, si lo haces muy bien, puedes obtener, por ejemplo, una resolución de 10 nm. Y esto es muy importante en el set-up. Y si, por ejemplo, quieres tener un 3D step, el truco es que usas la polarización del beam. Sabes que la polarización linear tiene dos componentes, S-component y P-component. Puedes separar la polarización y en cada polarización, pones un palado de la superficie. En la polarización S, pones un 2-pil y en el otro pones un P-pil. Y, de nuevo, puedes overlapar. Y con esta técnica puedes tener un 3D step. Si quieres correctar la polarización, es hoy expensivo, porque necesitas un S-L-M, un modulator especial. Con este dispositivo puedes cambiar la fase y reducir la polarización y obtener mejor resolución. Y el modulator especial, porque también puedes correctar la polarización. La polarización de la polarización puede ser correctada por el manufacturador. ¿Tu significado es la polarización debido al modulator especial o al lugar de la fase? Sí. Esta polarización del objetivo está correcta. Pero, si tienes un sample tic, hay más agresiones. Y en los pasos lindos, hay muchos elementos ópticos que agresaron la pones. Si pones el S-L-M y usas un algoritmo de la fidea, basado en el procesamiento de la imagen, cada vez tienes cada componente de la operación por el componente de Zernick. Y puedes correctar la operación para tener mejor resolución. La posición de estas moléculas también es controlada por la posición de la pones. En este caso, para detectar esta posición muy, muy decisiva, has encontrado la posición de la pones. Sí. Tienes dos opciones. Move the sample or move the beam. The beam. Usually people prefer to to scan the beam. There is a scanner mirror, a piezo scanner mirror in two directions, tip and tilt, to scan the overlap beam. I mean... Yeah, yeah, yeah, yeah. You go to a dimensional and the sample is on a piezo stage in an axial direction and by this method you get a 3D image. I want to know whether the samples need special repression and how they are done. The samples, whether they need special repression. Yeah, but I need to prepare the samples for the setup and how this repetition done. Move the sample. You can put the sample on a piezo stage. Two dimensional sample holder that has a piezo stage in two directions. So you can move the sample. Ok, ok, yeah. You need to attach forerford to sample because this forerford gives you the fluorescence emission. For example, yeah, GFP is forerford. And usually group auto fluorescence. I think GFP is auto fluorescence. Fix each of this protein in this part of the cell, the nucleus, I don't know. Also you can use different. Nowadays there are many, many kinds you will have this Marana election about green fluorescence proteins. There are many, many kinds of two fluorescence green fluorescence protein or yellow fluorescence protein, red fluorescence protein due to the fact that you need to differentiate between different parts of the cell. You attach one green fluorescence protein to this specific component and another yellow fluorescence protein as you saw in some of the application you have some molecules in green some molecules in red, for example microtubules in green acting in red due to the fact that you use different fluorescence proteins because you need to prepare the sample in this way. Comments I think this was to discuss with you and to have at least an idea for the next later of course you will have there to professor coming from Stefan and ideas to be at least this basis, concept in mind and say also to your help Comments Is there any other question? Take profit because this is an opportunity so if you have any doubt something ask because you have some expert you have the professor and so on so take profit because this is a unique opportunity Is there a, I have a question Is there anyone more working with these things apart You are the only one It seems that you are the only one Ok Do you want to add something or we can I would like to add one Stefan has received the Nobel Prize but many years I have nothing, many years before Stefan has received the award from the ICO the ICO prize ICO is the international commission for optics which is one the one who started with ICTP this winter college then Optical Society of America, SPIM many other institutions reached this group and he received this award if I remember in 2000 or 2001 but probably it's 2000 because we realized that it was in the committee that analyzed the proposals selected the proposals and we realized immediately that this depletion system of Stefan was a very important proposal and he received the ICO prize long before the Nobel Prize ok this is just a point of story ok so maybe we can have an interval a little bit longer than usual but maybe some people can take profit of speaking together going to the secretary and so on ok so see you at 11 11 ok molecules ok