 ناہ وی ٹیلس گاس میتہ دیویلپیمنٹ نہسٹویلسی میتہ دیویلپمنٹ ایک ایسہ تاسک ہے جو فارمسریکل اندسٹریز میں ریگولر پر فام ہورا ہوتا ہے نیہ ماتھرٹ کی ضرورت ہوتی ہے کیونکہ نئی افڑی اپرویف درؤکس کو ہاں فامولیشن میں استعمال کرتے ہیں باز اقات کوئی کام بینیٹنشن اپرویف کرتے ہیں افڑی ایہ تو ہم اس کے ذریعے نییدرک کام بینیٹنشن مارکٹ میں لانچ کرتے ہیں اور بسا وقت بیپی ای اسپی میں اس کے ریگولر مطلب موجود نہیں ہوتے اس لیے ہمیں خود سے نئے مطلب کرنے کی ضرورت ہوتی ہے انٹیکل کمسٹری میں باز وقت کو اس پیسفک ٹاسک یا انڈالائٹ کی کسی خاص کنڈیشن کے لیے اگر آپ اپلائے کرنا چاہر ہیں تو بھی ہمیں مطلب کرنے کی ضرورت ہوتی ہے اس مطلب کے مختلف فیزیز ہوں گے کہ سب سے پہلے ہم اپروپریٹ کولم چوس کریں گے اپنی اپنی اپلائے کنڈیشن کو اپروپریٹ کرنے کے لیے یہ کس کسم کا مولیکول ہے اور کس کسم کی کنڈیشن سے اس کو پاس کیا جائے اگر سپیسفک چاہسہ اپنا کرسکیں ٹی اٹین یا ٹی اٹ تو باز وقت ٹرینڈم لی ہمیں ایک سے زادہ کولمز کو رن کر کے بھی دیکھتے ہیں کہ انٹیکل کولم زادہ بہتر کام کر رہا ہے یا ٹی اٹین ٹی اٹ میں سے کوئی بہتر کام کر رہا ہے دوسری چیز ہم اب نے مبال فیس کی اجاستمن کرتے ہیں اور سب سے پہلے یہ اجاستمن تو آیسوکریٹک موڈ میں چلانے کے لیے کرتے ہیں کہ کسی خاص پیہچ پر آپ کا مبال فیس بہتر رن کر رہا ہے یا اس کی کوئی خاص کومبینیشن جیسے سیمپل کومبینیشن میں تو ہم water methanol یا water acitonitrile اور اس کے بعد مختلف اور کومبینیشن میں آپ کے انالیٹ پر بیس کرتے ہیں کچی بفرز بھی ہو سکتے ہیں جن کو ہم سپیسپیکلی استعمال کرنا چاہے ہیں آیسوکریٹی کے گریڈینٹ اس کو ہم نے دسکس کیا تھا کہ اگر ایک ہی مکسٹر کو ہم رن کر رہے ہوں تو یہ آیسوکریٹی کہلائے گا اگر ہم with the time رن کے دوران کومبینیشن کو چیج کریں تو اسے گریڈینٹ ڈیلیشن کہتے ہیں چایس of ڈیٹیکٹر دپن کرتا ہے کہ آپ کے مولیکول کی کمسٹری کیا سی ہے اگر وہ UV ڈیٹیکٹر ہے یا PD ڈیٹیکٹر بہتر کام کر سکتے ہیں لیکن اگر chromophore موجود نہیں ہے کوئی color absorbing کمپنٹ اس میں موجود نہیں ہے تو پھر refractive index ڈیٹیکٹر یا evaporating light scattering ڈیٹیکٹر بھی استعمال کر جاتے ہیں اور اگر کوئی ions ڈیٹیکٹر کرنا چاہے ہیں بسا وقات ہم positive cat ions کو بھی separation کے لیے hplc استعمال کرتے ہیں اس ورط میں ہمیں ion conductivity ڈیٹیکٹرز کی ضرورت بھی پڑھ سکتی یہ sketch اس وقت ہمیں show کرنے کے لیے ہے کہ molecule کی size اگر چینج کرتے جائے تو مختلف کسم کی chromatographic تیکنی کے مستمال کرتے ہیں جیسے gel permeation یا ion exchange اگر بہت بگر molecules ڈیٹیکٹر اتنے زیادہ molecular weight کا مطلب کہ protein کی molecules ڈیٹیکٹر 1,000 تک molecular weight جنہیں small molecules ڈیٹیکٹر جانتور پر for muscle ڈیٹری میں استعمال بھی ہوتے ہیں وہ ہم reverse phase bounded silica یا normal phase یا small molecule gel permeation یا اس کے لبہ کچھ ionic یا non ionic conditions بھی استعمال کرتے ہیں یعنی یہ hplc کے لیے اور یہ normally fplc کے لیے یا protein کی filtration اور chromatography کے لیے استعمال کی جانے والی تیکنیق سے high performance or low performance جس میں ہم high pressure pump استعمال کر رہے ہیں یہ high performance liquid chromatography بھی کہراتی ہیں اور عام طور پہ ہمیں sharp peaks ملتی ہیں جسکی اس فگر کے اندر ہیں لیکن اگر پیچھے آپ کے کولم میں پیکنگ بہت swift ہوئی بھی ہے tightly packed ہیں لیکن mobile phase اتنا بہتر ننہ کر پائے تو پھر ہمیں یا بہت slow move کر رہا ہو low pressure تو پھر ہمیں اس کسم کی زیادہ affinity اور longer peaks مل سکتی ہیں یہ show کر رہا ہے کہ ہمارا compound کولم کے اوپر ذات دیرس sustain کر رہا ہے stay کر رہا ہے resolution بیسی کلی resolution سے مراد کے peak کتنا separate ہے ایک peak کہاں ختم ہو رہی ہے اور دوسری کہاں شروع ہو رہی ہے یہ جہاں پر بہتر separation مل رہی ہے اس کے لیے resolution کی value تکریبا 1.5 کی قریب نکلے گی اس کے formula ہم آگی دسکس کریں گے لیکن جہاں یہ peak ایک دوسر میں مرج ہو رہی ہیں اور ایک peak اس کے end ہونے سے پہلے ہی دوسرا compound شروع ہو گیا ہے اس کی resolution 0.8 یعنی 1 سے بھی کم ہے ہمیں theoretical plates بھی بتاری ہیں کہ جتنی زیادہ theoretical plates ہوں گی اتنا زیادہ ہماری column کی efficiency بہتر ہو گی اور چلنے کے ساتھ جتنا column efficiency drop ہوں گی اتنا یہ resolution بھی خراب ہوتی جائے گی یہ وہ formula جس ہم peak کی resolution کالکلیٹ کرتے ہیں w1 یا w a یہ peak ہمارج ہو رہی ہوں وہاں ہم extrapolate کر کے خص سے اس peak کی width معلوم کرتے ہیں کہ w a یا w b کیا نکلے گا t1 t2 ان کی time duration یعنی کس جگہ پر یہ peaks آرہی ہیں ان کے mid point سے اگر ہم مارک کریں تو یہ t1 اس کا time retention time explain کر رہا ہے اگر r کی value اس formula کی مطابک 1.5 آئے اس کا مطلب ہے کہ بہتر resolution 1 تک ہوتو باس کیسز میں اسے acceptable کرار دیا جا سکتا ہے اگر 1 سے بھی کام ہو تو پھر acceptable r یا peak resolution مناصب نہیں ہے یہ اس وقت آپ کے سامنے ایک sketch ہے کہ ہم نے column کو رن کرنا شروع کیا اور پہلے 2 منٹ کے اندری ہماری تمام peaks ایک دسرے میں مرچ ہو کے out ہو گئیں یہ شو کر رہا ہے کہ ہماری column has very little interaction with the compound ہمارا compound زادتر mobile face کے ساتھ انٹریک کر رہا ہے اس لیے mobile face کے ساتھ چلتے چلتے بھر نکلا ہے تو within 2 minute وہ column سے out ہو گیا ہے maybe اس case یہ بھی ہو سکتا ہے کہ ہماری elution speed بہت زیادہ ہو elution speed ایک ہت سے زیادہ تو ہم column میں apply نہیں کر سکتے عام طور پہ 1 to 2 amel per minute ہماری speed ہوتی ہے because سے زیادہ pressure apply کیا جائے تو پھر column کی breakdown ہونے کا ختشا ہوتا ہے بہرال اس میں کوئی separation نہیں ہو رہی اس لیے ہم اس method کو بہترین کرنے کے لیے یا بہتر کرنے کے لیے اپنے mobile face پے focus کرنے کے ضرورت ہوگی یا اس کا speed کم کر کے read and کرنے کے ضرورت ہوگی دوسری ایک observation کیا جیسے 15 minute کے بعد peaks آنا شروع ہوئی اور اگل تیس minute تک یہ peaks آرین ہے یعنی elution بہت سلو ہے آپ کا mobile face میں بھی بہت سلولی move کر رہا ہے آپ 1 or 2 amel per minute کی وجہ point 1 amel تو ایسے ہو سکتا ہے یا یہ بھی بتانے کے لیے ہماری peaks کافی ہے کہ ہمارا mobile face انٹریکت زیادہ سٹیشنی face کے ساتھ کر رہا ہے اور mobile face کے ساتھ بہت کم انٹریکٹ کر رہا ہے اس لیے بہت دیر سے 15 minute کے بعد peaks باہر آئی بہتر separation نہیں ہے ہماری کوشش ہوتی ہے 15 minute ہماری ایک analysis کی activity مکمل ہو جائے 10 سے 15 minute اگر ہماری تمام required chromatographic method سمجھ جائے گا یہ ایک بہتر situation اس وقت ہمارے سامنے ہے کہ ہم نے peak resolution بھی حاصل کی ایک سے زادہ sugar molecules جن کو separate کیا اس میں refractive index detector کو استعمال کیا گیا ہے اس میں 0.5 amel per minute یہ ہماری mobile face کی speed تھی اور column b 300 millimeter 7.6 millimeter ایک normal column استعمال کیا گیا ہے تو یہ بہتر peak separation ہے جب ہم condition کو satisfied کرتے ہیں اور optimize کر لیتے ہیں تو پھر ہمیں اچھی مناصف separation حاصل ہو جاتی sometimes ہمیں gradient illusion کی بھی یعنی time کے ساتھ ساتھ ایک concentration for example ہم نے اگر a mobile face کو water کو common رکھا ہے اور کسی خاص buffer کی concentration کو ہم بڑھا رہے ہیں تو ایسا کیا جا سکتا ہے اور time کے ساتھ ساتھ جو ہم concentration میں اضافہ کرتے ہیں تو ہمیں بساوقات زیادہ بہتر separation تب حاصل ہوتی یسے یہ ایک analytical method ہے جس میں 30 amino acids ایک ہی gradient illusion پر رن کیے گئے اینی previous guidelines کو سامنے رکھتے ہوئے اگر کوئی new method ہم نے develop کرنا ہو تو ہم ایک column selection کرتے ہیں پھر اپنے ph اپنے mobile face کی ph اور اس کی combination کو verify کرتے ہیں جو بہتر انداز سے illusion دیرا ہو اس کے بعد isocurative gradient جس میں ایک combination استعمال کیا جا رہے ہیں اگر in light کے تو آپ perform کریں method validation کو اس سے پہلے ہم دسکس کر چکے ہیں تو وہی method validation کے تمام tools کو ہم اپنے method کو validate کرنے کے لئے اختیار کرتے ہیں اور only validated method can be used for analysis purposes