 Ok, merci. Donc, je dois m'apologiser pour parler de DrabGTPS. C'est ce que tu as dit ? Non. Non. Non. Non, non. Ok. Je vous remercie. Ok, merci. Je voudrais remercier Nava pour organiser cette pandémie. C'est une grande opportunité pour interroger avec les mathématiques. Je dois dire que je suis en charge d'un grand programme, qui s'occupe de plusieurs instituts dans Paris. Le but de ce programme est d'interroger entre les biologiques, les physiciens, les mathématiques et les chemistes. C'est une bonne opportunité pour s'adapter à une rencontre comme ça. Alors, comme Kati m'a dit, je vais beaucoup parler de notre favorite DrabGTPS, qui est DrabSix. Donc, tu l'as déjà dit d'hier, de Jean-Cy-Chan et Judith complémentation de DrabGTPS. Mais je vais juste vous introduire encore, cette famille de protéines. DrabGTPS c'est ce qu'on appelle le RAS Superfamilie. Donc, comme vous le savez, cette famille Superfamilie contient beaucoup de protéines. Donc, vous avez un RAS, vous avez le RORAC CDC-42, le SAR-1 et cette famille DrabGTPS. Donc, toutes ces protéines, qu'on appelle aussi les DrabGTPS, ont exactement la même structure. Donc, ils ont un weight moléculaire entre 20 et 25. Et ils font tous ces domaines conservés qui sont involveés dans le binding de DrabGTPS et dans le hydrolysis de DrabGTPS. Et, en fait, DrabGTPS est une famille la plus grande de cette famille Superfamilie. Donc, comme vous l'avez dit, il y a environ 70 membres qui ont été identifiés en humain. Et en fait, nous ne savons pas quelle est la fonction exacte de la plupart. Donc, ce slide vous montre ce que nous pensons est la principale fonction d'un DrabGTPS. Donc, en fait, il y a deux principales fonctions qui sont relatives à l'un de l'autre. Donc, l'une des fonctions est de réguler virtuellement tout le transport entre les compartments de celles. Donc, DrabGTPS est involveé dans le binding de ces transports vécuels qui bougent sur un compartiment de la cellule à l'autre. Donc, ils sont involveés dans le mouvement de ces transports vécuels entre le macotubule ou l'actin cytoskeleton. C'est l'un des principaux effecteurs d'DrabGTPS, un moteur moléculaire, un myosin ou un kinésine. Et ensuite, DrabGTPS est aussi involveé dans le targeting de ces vécuels pour un membre accepteur. Et en particulier, ils recrutent un complexe de protéines qui s'appelle le tethering factor. Et un autre point qui ne sera pas adressé dans ce corps est que, en fait, il y a un cycle d'un DrabGTPS entre le cytoskeleton et le membre. Et ce cycle est comparé à l'activation de l'actin de DrabGTPS. Donc, un autre rôle important de DrabGTPS est de former des domaines de membre. Et ces domaines de membre sont très importants. Ils sont utilisés en plateforme signal. Probablement pour beaucoup d'autres fonctions de celles. Et l'un des meilleurs exemples c'est DrabGTPS qui est locée sur les endosomes. Et ces DrabGTPS recrutent une série de protéines à la fin des domaines de DrabGTPS sur les membre. Ok, donc c'est un outlook de ma discussion aujourd'hui. Si j'ai le temps, on parle des mécanismes qui ont la formation de DrabGTPS de DrabGTPS de DrabGTPS. Il y a des événements qu'on a maintenant. Ce n'est pas encore publié que DrabGTPS qui pourrait être un régulier général de DrabGTPS. Et si j'ai le temps, maintenant on a créé beaucoup de modèles ou de chaussures. Ok, donc DrabGTPS c'est un d'autres 5 ou 6 protéines de DrabGTPS qui sont concernées par l'évolution de ma mère et de l'homme. Et DrabGTPS c'est une de ces genes. Donc je ne fais pas de détails. Mais en fait, DrabGTPS et je parlerai beaucoup d'aujourd'hui de ces deux isophones qu'on appelle WAP6A et WAP6A prime. En fait, c'est unique exemple entre les familles de DrabGTPS. Donc ces deux isophones sont générées par l'attentif de la même gene. Et en fait, les deux protéines sont très très proches. Et encore, nous ne savons pas qu'ils sont localisés à exactement le même compartiment dans le sel. Mais en fait, ils sont probablement de différentes fonctions. Ok, donc j'ai travaillé de mon laboratoire depuis plusieurs années et d'autres qui ont appris ce modèle de WAP6A. Donc WAP6A est localisé au complexe de Gorgie et peut-être principalement sur le site trans de Gorgie et le Network de TransGorgie de TGN. Donc WAP6A a en fait réglé plusieurs sévères transports à ce niveau. Donc l'un de ces transports je ne parlerai pas d'aujourd'hui de ces transports c'est le passway qui connecte dans le système mat à la Gorgie. Et ce passway est utilisé par bien sûr d'autres protéines pour recycler mais aussi par exemple des toxines comme Chiga toxines pour entrer le sel et intoxiquer le sel. L'autre fonction de WAP6A que je vais illustrer dans un moment c'est de réguler les transports antérogrés donc les transports de TGN au membre de Plasmo. Et WAP6A est également intervérée dans les transports vétrogrés entre Gorgie et le plasmic ridicule. Ok, donc la première partie de mon truc c'est pour présenter les mécanismes que la formation de WAP6A de Gorgie et de TGN du membre. Ok, donc ce que nous avons publié plusieurs années auparavant c'est que l'activité du système est requérée pour l'utilisation pour cette formation. Donc, c'est la situation normale donc c'est la cellule de contrôle. Donc, par exemple c'est ce dont je l'ai fait c'est l'expression de GSP WAP6A ou WAP6A par exemple. Donc, c'est une cellule donc c'est la Gorgie et c'est tous ces vesicles qui bougent ou vont retourner vers la Gorgie. Donc, c'est la situation normale. Maintenant, si vous bloquez je veux dire si vous bloquez la 2 avec l'inhibitor donc ce que vous commence à voir c'est l'apparence de ces tubes qui sont toujours connectés avec la Gorgie et en fait ces tubes correspondent à des vesicles qui ne peuvent pas serrer vers la Gorgie. Donc, en fait quand vous vous avez essayé de voir ceci depuis longtemps avec Patricia donc si vous vous mettez sur la Gorgie avec un moteur moléculaire micro-tubule donc si vous l'inhibitez dans l'invent vous verrez la formation de cette membrane. Ok, donc maintenant on a essayé de comprendre en plus les détails de cet travail et en fait donc ce que nous avons fait recentement c'est de regarder careful ce qui est en train de je veux dire au niveau de la Gorgie. Donc maintenant c'est le zoom sur la Gorgie complexe donc c'est la RAP6 et la Gorgie et si vous regardez careful donc c'est tous ces vesicles qui sont de la Gorgie membre et en fait si vous regardez careful vous verrez que la majorité de vesicles sont toujours de la même place à la Gorgie. Donc c'est ce qu'on appelle un endroit de des vesicles de formation à la Gorgie. Donc c'est montré en plus sur cet état donc c'est de la même film. Donc vous pouvez traiter ces vesicles et en fait si vous regardez ici vous voyez qu'un vesicle est en train de former à la même place. Et aussi ce que vous pouvez montrer c'est que si vous si vous traitez avec le bébé qu'on bloque mes deux activités donc comme je vous le montre vous voyez ce ce ce tube qui est connecté à la à la Gorgie membre d'un effet fichier. Donc en fait ce processus c'est réversible donc vous pouvez ouvrir le bébé 13 et puis le secret passeway commence again et puis vous commence à faire les tubes disappear vous faites des vesicles encore et si vous regardez carefully vous pouvez voir que ces tubes membre aussi forment à cet état de Gorgie membre Ok donc la question c'est de comprendre comment cette Gorgie fichier peut être formée et donc nous demandons si il y a une connexion entre les actifs et le network pour expliquer ce ce spot donc comme je vous le dis donc mes deux c'est involvement dans ce processus et en fait longtemps on a also shown que c'est un mécanisme à la fois qu'on appelle un mécanisme 6 maintenant il s'appelle la littérature kiff 20a ou mklp2 parce que c'est un moteur important dans la division et si vous donc nous réadresse cette issue récemment et regardez la localisation de kiff et comme vous pouvez le voir vous pouvez détecter la poudre de kiff 20a que c'est localisé co-localisé avec un G130 ou TGN 46 qui est présent sur cette gg membre et en fait il y a un individu spécifique de kiff 20a qui s'appelle papotrain maintenant c'est un individu en fait avec des issues pour par une small company à développer anticancer je veux dire c'est dans le cancer je veux dire c'est dans le cancer ok alors en de sur le partage à la première nous c'est une kinésine qui nous mais en fait ce n'est pas le cas, parce que quand vous inubilez l'activité de Kynazine avec cet inubileur, vous aussi voyez l'apparence de ces tubes membres que j'ai décrivés après l'inhibition de Myzine II, ce qui signifie que l'AQ20A était aussi invoissante dans le processus officiel de cet inubileur. Ok, et puis, ce que nous essayons de faire, c'est d'observer l'organisation de ces protéines, donc Myzine II, Kynazine II, GFU rap6 et Kynazine II, donc vous trouvez la cellule avec cet inubileur, et puis vous regardez où les protéines sont localisées sur ces tubes membres, et vous pouvez voir que à la base de ces tubes, vous pouvez détecter les rap6, Myzine II et Kynazine II. C'était un argument pour dire que peut-être que les protéines soient invoissantes dans cette machine officielle. Et en fait, le travail de notre laboratoire et d'autres ont aussi dit que, en fait, ces 3 protéines, donc nous savons que les rap6 s'interrogent avec Kynazine II, les rap6 s'interrogent directement avec Myzine II, et en fait, Myzine II aussi interroge avec Kynazine II. Donc, il y a une networks complexe d'interaction entre les 3 protéines. Et donc, pour aller plus loin, donc ce qu'on peut montrer est que il y a un complexe entre les 3 protéines que vous pouvez, vous pouvez immunoprecipiter les 3 protéines. Et aussi, ce que nous avons pu montrer est que, en fait, pour avoir une interaction entre Kynazine II et Myzine II, vous avez besoin de rap6. Donc, ceci est montré juste dans ce panel. Donc, ceci est un expériment classique. Donc, ceci est un expériment classique d'expression GFP, Kynazine II, donc vous faites un IP, donc vous pouvez voir que vous pouvez immunoprecipiter Myzine II avec Kynazine II, GFP ou Andogenus. Maintenant, si vous retirez rap6 par SIRNA, vous voyez que vous ne pouvez pas immunoprecipiter Myzine II anymore. C'est-à-dire que rap6, vous avez besoin de rap6 pour la interaction entre les 2 protéines. Ensuite, ce que nous pouvons montrer aussi, c'est que Kynazine II, en fait, est requiert pour le recrutement de Myzine II sur le membrane Golgi. Donc, ceci est montré dans cet expériment. Donc, c'est la situation de contrôle. Donc, vous quantifiez le signal de Myzine II que vous pouvez voir dans le membrane Golgi. Si vous retirez Myzine II par SIRNA, vous n'avez pas plus de signal. Si vous retirez rap6 A et apprêtez aussi, vous diminuez Myzine II dans le Golgi, ce qui signifie que rap6 est involved dans le recrutement de Myzine II dans le Golgi. Mais si vous retirez KIF-20A, vous diminuez aussi le nombre de Myzine II dans le Golgi. Ok, donc, pour mieux comprendre ce qui s'est passé, nous avons fait un recrutement entre la cellule et le nocodazole. Et ensuite, nous avons fait un expériment appelé recrutement de micro-tubules. Donc, comme vous le savez, le membrane Golgi est capable de nucléer les micro-tubules. Et ces micro-tubules sont en fait utilisées pour le traficage post-Golgi. Donc, si vous le faites, vous pouvez aussi montrer que vous retirez la cellule et le nocodazole. Et ensuite, vous retirez le nocodazole. Et ensuite, vous pouvez voir que KIF-20A peut collocer sur ce gros micro-tubule du membrane Golgi. Et le dernier expériment que j'ai voulu vous montrer avant le modèle est l'expériment de frappe. Donc, en fait, ce que nous avons fait, c'est de frapper. Donc, c'est le nocodazole. Donc, vous frappez le Golgi et ensuite vous regardez le nocodazole et vous regardez le récouverteur de la fluorescence. Et ensuite, vous comparez. Donc, vous mesurez, en fait, la diffusion de la frappe 6 dans le plan du plasma membrane. Donc, si vous utilisez, si vous retirez la cellule avec ce KIF-20A inhibiteur, vous voyez que vous décrivez une demi-heure de récouverteur, meaning that in fact, the diffusion is faster when you inhibit KIF-20A. So, we show you the model. Yeah, so also, I mean, to understand, we measure the relative affinity between the three proteins. So, I show you the model. So, what we believe is greening is for real. So, this is a Golgi membrane, a TGN membrane. So, I think that the first event is, so RAP6 is diffusing on the plane of the Golgi of the membrane. And then RAP6 probably we could first KIF-20A and then myzine 2. And then this makes complexe between the three proteins. And then the vesicle form from Golgi membrane. And this vesicle move along macrotubules. And then the acting network is used to fichin the vesicle from the Golgi membrane. So, it's an example of, actually one of the very rare examples of probably a connection between Golgi, between acting and macrotubules to form a vesicle from the Golgi. Ok, so, my second part of the... On a question to the previous slide just one second, because you moved further. Sorry, what does 1, 2, 3, 4, 5 means? The number? It is a step. But they go like in the circle? No, no, no, no. It's a model. So, we put number to say, ok, so you have first RAP6, and then RAP6 recruit myzine 2, then recruit KIF-20A, and then this man. And then what is the difference between 4 and 5? Ah, it is made... 4 and 5 you have this. So, in further the system is in place. I mean it's... And then, the vesicle form, and then the vesicle is cut from the Golgi, and then move away from the Golgi. So, it is not like, it can be in any place. So, it can, because it goes 1, 2, 3, 4, and then 5. Yeah, yeah, yeah. So, maybe the model can be improved now. No, it's not just to understand. No, no, no. So, I mean, yeah, I see what you mean. So, this is, yeah, this is the hotspot, if you want, here. And then, no, I mean, yeah, it's a way to represent. It's just the order of events. It's an order of events. No, no, no, no, it's not partial. I mean, it's, I mean, probably the event takes place at the same place, very close to, but... Mm-hmm. Yeah, I'm sure. Ok, one quick question. Do you think there's any involvement of a GTP, GTP cycle that would regulate really RAP6 in his model? Yeah, I think there is probably a cycle. But the big problem with RAP6, we don't know exactly the gap and the gap. So, it's difficult. Ok, so, if he would be working, it would be working. It is, it is not like a special distribution, because anywhere. No, it's not special, as Tomi said, it's the order of events. Excuse me, I miss what myosin2 is doing here. What is myosin2 doing here, I didn't understand. So, what we believe that myosin2, so if you inhibit myosin2, you cannot fission this physical. So, we believe that myosin2 is involving the fission. You know. No, we, I mean, there are several hypothesis. So, we try to, with Patricia actually, to reconstitue this assay in vitro on giant liposome. I mean, there are several possibilities. So, and also, we don't know exactly the acting organization at the Golgi. So, we know there is acting around the Golgi, but I mean, how it is organized, if it is branch acting or acting filament. I mean, I think this is not why not. So, it could be that, I mean, one possibility. So, maybe Patricia can explain better than me that, I mean, maybe you have myosin2 on the plane of the membrane and then you have this contraction. And, I mean, you have some studies that have shown that this contraction of myosin2 can induce phase separation of lipids. And this phase separation could be directly involved in the fission process. But, I mean, to be clear, we don't know. You know, is the actin getting nucleated, is it arctupree, or cornins, or wash proteins? Yeah, we know that, I mean, there is, after 2, in the Golgi, there is all, I mean, all the acting nucleators present at the Golgi. You didn't see the C42, right? You didn't see the C42. And also, yeah, C42 is also involved somewhere in this. Are they at the hotspots? It's a good question. I think, yeah, we have done some standing with arctupree, and, yeah, it seems that this arctupree could be present at the hotspot, but it's not. Ok, second part of my talk, which is not published, is some evidence that we have to say that Trapsis could be a general regulator of post-Golgi trafficking. So, for this, we use an assay, so-called rush assay, that actually have been developed by the group of Franck Pérez, at the Institute Curie, the cell biology department. So, in fact, it's an assay that is based on the avidine stratavidine system. So, in brief, you make a hook in the ear, and then you tag cargo with stratavidine binding protein. So, in normal conditions, this will allow the retention of this cargo, secretary cargo, in the ear. And then you just add biotine, the vitamin, in the medium. So, and then this association between the cargo and the hook in the ear is released, and the secretion is working. So, I will show you. So, and you can do this with a wide variety of proteins. So, I will mainly talk today about three proteins, three cargo, that we follow. One is a GPI hardcore protein. Another one is a transmembrant protein, TNF-alpha. And the last one is a soluble cargo, collagen 10, that we heard yesterday from Alberto's talk. Ok, so, just to illustrate the rush system. So, this is CD59. So, this is the beginning of the experiment. So, this is CD59 present in the underplasmatic reticulum. So, then you just add biotine to the medium. And what you can see is that the protein leaves the ear, reaches the Golgi, and then Golgi, and then reaches the plasma membrane. So, it's a very nice way to synchronize transport between the ear and the plasma membrane. And I can just show you also with collagen 10. So, it's the same. So, beginning of the experiment, collagen 10 is in the ear. Then you add biotine, sorry. Then it reaches Golgi, and then you have this vesicle. And collagen 10 is soluble protein. So, it's released into the medium. Ok, so, doing that, so, we look carefully using this assay, where actually the exocytosis takes place. So, I just illustrate with collagen 10. So, this is the movie. So, I will show you. So, this is the underplasmatic reticulum. So, after 10 minutes, majority of the protein is in the Golgi, and then it's reaching the plasma membrane and the extracellular medium. And actually, so, I show you the movie. Ok, and then, so, at the end of the experiment, basically you see nothing because probably collagen 10 has diffused out of the cells and it's going to the extracellular medium. So, actually what we did is to coat, I mean, we devised an assay. So, in fact, so, of course, the cells are grown on the cover slip, but you coat the cover slip with an antibody against GFP. So, when the protein that is released in the medium, so, after exocytosis, so, if, I mean, all these cargo have GFP on it, and then, so, because the cover slip is coated with anti GFP, the protein that is secreted is in fact trapped at this site where exocytosis has occurred. So, if you do that, you see, so, again, the same experiment, so, except it is shown, it is, sorry, it is done on coated cover slip, so, again, so, and now what we can see is that, I can show you again the movie, so, it's Golgi, the medical, and then, at the end of the experiment, you see that in fact exocytosis did not occur randomly at the plasma membrane, but, in fact, on, what we can call also hotspot of exocytosis, and, in fact, if you look carefully, so, the pictures are not great, so, they are better on my computer, but, so, if you, if you stay in the cell with Paxilim, which is a marker of the focal addition, so, where the cells adhere to the cover slip, you can see that most of the, I mean, all this, the cargo and the, in fact, exocytosis, so, reach the plasma membrane, very close to this focal adhesion, focal adhesion site. Now, if you look, okay, so, this is a complicated slide, so, I will go, so, then what we, so, as you know, and maybe I did not say clearly, so, post-golfie trafic independent macrotubules, all these vesicles move along macrotubules to reach the plasma membrane, and then, so, if you do this experiment, you can, in fact, track all these vesicles with these different markers, and what we can, we are shown is that, so, if you do this tracking experiment, so, you can define the tracks of these vesicles, les vesicles reaching the plasma membrane, near the focal adhesion site, have used, so, they use macrotubules tracks, which is shown here, but, in fact, they seem to use always the same macrotubules, so, there are many macrotubules, but, I mean, macrotubules can be used several times to transport this, this, this carrier. Ok, so, to move further, so, what we have done is to look what could be the machinery that is present near the focal adhesion site to sustain this intercetary. So, in fact, this has been shown 10 years ago by the group of Anakmanova, in, now, in Utrecht, so, what is known in the field, so, this is a macrotubule, so, this is a focal adhesion, and, in fact, near the focal adhesion, and, you have a link between the macrotubules and this focal adhesion site, and, in fact, one of the players of this, of this formation of this site, is a protein called ELKS, or, also, CAST, so, it's a protein of the active zone in, in, in, in neuron, and this complex, in fact, allows the anchoring of macrotubules near the focal adhesion site, and it turn out, in fact, that ELKS is a rap-6 effector, and so, if you, so, this experiment shows you, so, this is a controlled situation, so, you can see, this is a GFP ELKS, now, if you remove, so, GFP ELKS, so, it's localized on the plasma membrane, but it's also concentrated at the focal adhesion, as suggested by the, by the model, but if you remove ELKS, with deeply to ELKS, by SCRNA, you can see that, in fact, you lose this preferential targeting of exocytic marker to the, to the, to the plasma membrane, because, so, this is quantified in this experiment. So, then, so, you have some preferred site of exocytosis, you have this protein rap-6 effector ELKS, that seems to be involved in this process. So, then, we look more carefully at what could be the role of rap-6 in this, in this process. So, it's, so, what we did is to, so, to use, I mean, all this, the three cargoes that we, that we were, I was talking about, and then to quantify the amount of vesicles that carry PNF alpha, collagen 10, that are also positive for rap-6. And so, we look at different step, one at the late stage during exocytosis of this vesicle to the plasma membrane, and, so, this is my turf experiment, and if you quantify, you see that, I mean, over 70 or 80% of, for instance, the vesicles that contain CD59 are also positive for rap-6. So, it's the same for collagen 10 or soluble TNF alpha. Now, if you look at the Golgi exit, so, the first step, so, you look, so, this is the Golgi, and again, you quantify the vesicles that form, from the Golgi membrane, and how many contain rap-6. And, as you can see, also, the majority of this vesicle do contain rap-6. And, it's the same in the vesicle, in root to the plasma membrane, the vast majority of them are rap-6 positive. So, in fact, this is, this was a bit surprising, we are not expecting this result, that rap-6 will be present on many vesicles living. If you inhibit the myosin tube, as you showed before, and you track now the collagen, guys, are the tubes containing a continuum of the collagen, or is it anything? Yeah, yeah, for this, so, we did this experiment with all the cargo to treat, to inhibit myosin too, and we see tubes, and this tube contains this cargo, yeah. No, no, but the collagen we heard is making this long filaments, right? So, is it... Ah, this collagen, is this collagen 10? So, the question is, what is it, what is exactly your question, so, is it... The collagen is polymerizing in these fibers, right? So, we heard in the V-lex talk that there was this large carburetor, right? So, I'm curious, if you prevent the fission, you get these long tubes on this machinery, do you now see compartmentalized bits of collagen, or is it a continuum tube? It's a good question, I think we did not, I mean, we should look carefully. So, what we have seen is, you see collagen in this tube, okay? It seems to be discontinuous, I agree, but to be honest, I did not pay attention to the organization of collagen in this tube, but maybe... Do you know anything about the size, same similar question, are the collagen vesicles look bigger than the other vesicles? Yeah, so, yeah, so, this is collagen, so, but I think V-lex was using collagen 7, right? Oh, I don't see. So, collagen 7. There are only three collagen that make this long fiber, it's number one, two, and three, okay? Other collagen are big molecules, but they have kinks, so they can form on themselves. We don't expect you to know, okay? So, collagen 7, plan, all set. When you're doing these three movies that you showed to us, it appears to me that the collagen was a very, it's a synchronized excess from the Golgi, whereas the other one, so it's much more spread, right? It's difficult to say, so I don't know exactly, no, it's... You're very sharp, because you've got, right? Yeah. But if you look at the CD59, it appears to me much softer. Yeah, yeah, maybe for this, so actually, Franck is analyzing now in detail, or this type of movie, you see, what exactly the kinetics and... The vesicles look bigger on that. Yeah. The collagen. Yeah, that's, you have noticed, that's, they're brighter, that doesn't mean that... They're brighter. Yeah, but you don't have the resolution. TNF alpha, it's a bit different. No, they are big also, right? It's difficult to say for... It's like watching the fight. Okay, so I show you this slide. And then, of course, it was important to show that, so this has been shown already with VSVG, that what we use as a particular marker, is to look at, I mean, the effect of, when you remove Rapsix, what is the effect on the secretion. So, I just show you the experiment done with TNF, TNF alpha. So, this is a control, and this is after depleting Rapsix by S.C.O.N.A. And then you quantify the amount of TNF alpha at the plasma membrane after removing Rapsix. And you see that, for instance, after 30 minutes or 60 minutes, you decrease by 50% the amount of TNF alpha. So, in fact, Rapsix do not block, I mean, removal of Rapsix do not block secretion, but just delay secretion. And also, what you can see, so this has been done with mouse embryonic fibroblasts. So, I will talk to you about this Rapsix no carb mice. So, and then, in this case, you measure the total protein secretion. So, you just label the cells, and then you look at the amount of protein that was released in the media men. And as you can see, after one hour, you see that more than 50% of the total protein in the medium has been inhibited. So, this is, again, an argument to say that Rapsix is, I mean, is involved in transport of many types of proteins. Okay, and the last experiment that I want to show you was to, I mean, so the question was if Rapsix could be involved in sorting. So, as you know, so we heard yesterday, one of the major functions of the TGN is to sort proteins. So, the protein are going to different destinations, to the plasma membrane, to another plasma system. And, I mean, at least the dogma is that all the, these cargoes that go to different locations are sorted into different populations of vesicles. So, what we did to know if Rapsix was involved in the sorting of cargo is to use, I mean, to express two or three cargoes in cells and look at the vesicles that contain one cargo or two cargoes and what was the percentage of these vesicles that were positive for Rapsix. So, I just show you, I think this is with TNF-alpha. So, if you look, so in yellow, so actually this, sorry, I cannot read it here, but I think it's TNF-alpha. Ok, c'est TNF-alpha et CD59. Or, anyway, so it's not important, so because it's always the same. Ok, so let's say it's TNF-alpha and CD59, so you see that about 50 or 60% of vesicles contain the two cargoes. Ok, and then you have about 20% of vesicles that contain only one cargo. Ok, so actually the percentage of vesicles that contain two cargoes is very high, it's about a second percent, but this can be due. So, we talked yesterday about this massive. So, probably there is a sorting between the two cargoes, but because you increase the, I mean, there is a big flow of membrane. At one point, probably you overcome the sorting machine. But still, you have 20% of vesicles that contain one cargo and 20% of the other cargo, meaning that the sorting go on and then take effect. And then, so, we look at the percentage of vesicles so they contain two cargoes, only one cargo that also carry vesicles. And in fact, this percentage is the same, so you have about 60% of vesicles containing two cargoes that are positive for rapcics, but this is the same percentage of protein containing only, of vesicles containing one cargo. So, this is an argument to say that, in fact, rapcics is not involved in the sorting of this vesicle. But, so the vesicles are formed, but they associate with, but rapcics associate with this vesicle. Ok, and this is our model, so it's the same scheme than previously. So now, so this is the microtubule, so this is the adhesion, I mean the exhaustive hotspot near focal adhesion. And so what we propose is that, in fact, this post-gold G-trafficking is controlled by a co-machineries that is made by rapcics, rapcics effectors, and the microtubule. So again, this is not in non-polarized cell, so we don't know exactly what is going in polarized cell. So there are several hypotheses, so one which is relatively simple, that this exocytic domain, I would say, simply reflect the global architecture of the cell, which is dictated by the organization of the actin and the microtubule network. Or, maybe this also is due to functional links, and we know that they exist between Cauchy-Mambrain and Focal adhesion, and this link, which are important for cell adhesion, polarization and migration. Ok, so I have, maybe, it's gone. Can I have five minutes more, or maybe, shall I just show you some? So as I told you at the beginning, so we try not to use, I mean to study the function of rapcics in the context of the organism. To do so, we have generated a conditional rapcic knockout mice, so this is a classical Quilox system. In fact, rapcics is an essential gene, and it's required for embryogenesis. And, in fact, the mice that are almost the good for rapcics in ULLL, in fact, they die at a day 5.5. And actually, the phenotype is exactly the same that you found when you knock out beta-1 integrates. So, if you look at the textbook, so this is a contract situation. So, at day 5.5, there is a formation of this basement membrane between the visceral underderm and the epiblast. Ok, but if rapcics is not present, you see that this basement membrane cannot form properly. And it's known that beta-1 integrin and beta-1 integrin signaling c'est le but pour la formation de ce basement membrane. Et, en fait, il y a une possibilité d'expliquer ce phenotype. Il y a un travail publié dans la coopération avec Ludger Ioannes. Donc, en fait, ce que nous avons fait est que, donc, nous avons discuté qu'il y a des recyclings de integrin. Donc, en fait, il y a un passage qui utilise ce, je veux dire, ce recalculation d'un poulon inactif de integrin sur le complexe de Golgi, probablement pour être réadressé à l'aide de la cellule. Et ce passage de recalculation d'un poulon inactif de integrin utilise rapcics et toute la machine pour ce passage de photographe. Donc, c'est peut-être pourquoi nous avons cet effet durant l'ambriogenie. Ok, donc, juste briefly, donc, ce que nous avons fait, c'est de couper ce maïs, le maïs, avec beaucoup de maïs, pour, je veux dire, couper les rapcics dans un certain niveau spécifique. Donc, nous allons juste vous montrer deux exemples, ce qui a été publié. Donc, pour étudier le rôle de rapcics pendant l'ambriogenie, nous collons ce maïs avec le maïs, donc, il a travaillé en collaboration avec Grasse Araposo, aussi à l'Institut Curie, et si vous regardez ce maïs, donc, ce maïs ne peut pas exprimer les rapcics dans l'ambriogenie, et vous voyez que ce maïs a un effet pigmentaire. Donc, maintenant, si vous regardez le, je veux dire, l'ambriogenie et l'ambriogenie, donc, l'ambriogenie pigmentaire. Donc, je ne vais pas entrer dans le détail, mais si vous l'aviez, donc, ce sont les maïs normales, l'ambriogenie, donc, appris par rapcics. Donc, ce sont les contrôles, donc, ce sont l'ambriogenie, et si vous, dans ce maïs, vous voyez que vous avez beaucoup moins de melanin dans ces melanosomes, et en fait, donc, donc, c'est le maïs, donc, je vais commencer, mais si vous regardez carefully, donc, vous voyez, donc, ce sont les melanosomes, je vous montre de nouveau, et vous voyez rapcics vesicards qui bougent pour ces, pour ces melanosomes. Donc, l'interprétation de ces données est la suivante, donc, en fait, dans cette cellule, rapcics définit les passways qui connectent directement la Golgi à stage 3 ou les matures melanosomes, et cette passway est importante pour transporter un set de enzymes pour ces melanosomes. Donc, en fait, en ce cas, et je pense que c'est assez intéressant, donc, les passways de secrétaire, j'avais dit avant, il y en a encore, mais dans cette cellule, donc, dans cette spécialisation, en fait, partie de la passway de secrétaire semble être divertie à ces melanosomes, et cette passway utilise la même machinerie, donc, je n'ai pas de temps à dire, mais aussi, cette protein E-LKS est importante pour le targeting de ces vesicards pour les melanosomes. Donc, je ne peux pas vous montrer toutes les données, mais juste parce que c'est important pour mon dernier message, donc, c'est un message que j'ai juste récentement élevé dans le journal d'expérimentation de la médecine. Donc, maintenant, c'est à propos de ces cellules signalées, donc, encore une fois, c'est une collaboration avec Clarive Rose, aussi dans l'Institut Curie. Donc, maintenant, on crée les melanosomes avec les melanosomes CD3. Donc, en ce cas, vous coupez les melanosomes dans l'infosite T-line. Donc, juste une introduction brief, donc, nous nous parlons maintenant de les cellules T-celles et cellules T-celles signalées, donc, comme vous le savez, il y a beaucoup de protein involved, et il y a un protein qui s'appelle LAT, qui est en fait partie de ce complexe de cellules T-celles, et cette protein, en fait, LAT, donc, c'est-à-dire un cycle entre le membrane plasma et la pulmine vesiculaire. Et donc, si vous... Sorry. Donc, si vous regardez à, je veux dire, ce qui se passe dans Web 6, knock out mice. Donc, encore une fois, pas dans le détail, mais en fait, vous décrivez l'obligation de cette cellule de l'infosite pour former des synapses immédiats, et aussi, vous avez une forte inhibition de l'activation T-celles, de l'activation T-celles. Et l'interprétation de ces résultats, je vais juste vous montrer un petit moment. Donc, en ce cas, donc, encore une fois, vous avez Web 6, mais maintenant, Web 6 ne semble pas être directement involvementée dans le transport antérieux de LAT, ou d'autres protéines, de l'alcool à le membrane, mais le phenotype peut être expliqué, mais ça n'effectue pas le rôle de Web 6 dans le transport retour. Ok, donc, vous dépliquez Web 6, et, je veux dire, vous inhibez le transport retour de LAT, et c'est pourquoi vous avez cet effect sur les synapses T-celles. Donc, ok, donc je vais... Donc, et c'est ma conclusion. Donc, comme je vous le montre, Web 6 semble être une protéine essentielle qui contrôle beaucoup de transports, mais encore une fois, Web 6 semble être involvementée dans des transports spécifiques, dépendant, en fait, de l'alcool et de l'alcool. Et donc, la question que nous avons maintenant c'est pourquoi, je veux dire, c'est-à-dire, qu'on peut croire que l'effect de l'introcellularité de l'introcellularité des transports spécifiques peut être un jeu d'effects. Donc, c'est... Oui, donc, je pense que... Oui, donc, on essaie de comprendre tout ce qu'on a dit, et de montrer ce que pourrait être la fonction de Web 6. Et finalement, les gens qui ont fait le travail, donc, la plupart d'entre eux qui l'ont dit aujourd'hui ont été faits par mes assistants, j'ai été Stéphanie Misre-Lanquet, PhD student à Malscasserie, un très bon ingénieur, Hugo, et le former postdoc Carina, et la main collaboration à Franck Pérez, Anoudus, Ludger UNS, Cédric et Grassa Raposo, Clérive Rose et Marina Glucova. Donc, elles sont toutes locales en collaboration de l'acité de Curie. Merci. Sorry, I have been too long. The day is really compelling, but it's a very confusing picture because it's like involved in everything. And so, do you view it more as a general regulator of classical formation and then transport and fusion of post-coach of classicals regardless whether they're regardless of what the destination is because you've seen round six and you've implicated round six in secretion now, but before in retrograde transport and also in vestibules coming back to the Golgi. So, it's at every step. So, is it because you have other specificity determinants rounds or arps or something that will add specificity to these vesicles? And rap is just a general factor or, as you were saying, in different cell types rap six is doing very specific things and you're just mixing up sounds and all the data altogether looks like it's doing everything, but then in each cell it's just doing one very specific thing. No, it's a very good question. So, actually, this is why we try to do this work in mice. No, I mean, I think that rap six one of the main functions of rap six which is not could be related to retrograde transport so in post-Golgi trafficking and to that pathway. So, I think rap six is a major protein involved in the targeting of these vesicles. So, along my contribute they are targeted to this. So, the role of rap six is targeting. So, you have rap six, you have this protein LKS or cast and this target is vesicle, probably all kinds of vesicle that go to the plasma membrane to this site of exosciences. Ok, so, the function of rap six in retrograde transport is maybe not disconnected. So, this has been shown by maybe not directly, but so rap six as a steady state is on the Golgi membrane and so you have these vesicles that come from endosomes and now rap six could be involved in the VPS complex, this GARP complex could be involved in the tethering of vesicle coming from endosomes with Golgi membrane. So, the two situations I mean, you can probably the same protein can do the same job at the same time, right, for this. But what about rap eight, then what is it doing? Different vesicles to learn? Rap eight, so, what what Akmanova has shown is that Anna Akmanova has shown is that in fact, there is a kind of cascade between rap six and rap eight. So, you have, so what Anna is thinking that vesicle that move I mean that from the Golgi are both rap six and the rap eight positive. So, rap six would be involved in targeting to the plasma membrane and the rap eight would be more involved in the fusion process by itself. But this is not how we can see. Ok, maybe one last question. Oh, you know, we will we'll see. One quick question. I mean Ok, so what my question is indeed it looks like there is a link to my cotubules. But what you described is remarkable is that you have a specific my cotubules. So, how do you think this specificity is achieved? And do you think that those are my cotubules that are nucleated locally and that's why they repeatedly make the same transporters to those vesicles and how do you make sure that your vesicles get to the right to the right my cotubules? It's a good question. So, yeah, we believe that I mean my cotubules are nucleated. I mean, yes, it's I mean, now we are doing experiments in cells. Actually a cap for 50 knockouts cells that cannot form my cotubules from the Golgi membrane. And this will be the I mean a way to know, I mean to answer your question. But in other words, in terms of you think rap six is directing the specificity for specific my cotubules? No. I think it's I mean, if rap six is directly involved in the I mean to nucleate specific my cotubules. To make sure that your vesicles stay on the right. I don't know. Because obviously all my cotubules are my cotubules. Yeah. Yeah. I think it's a good question but we don't know. I think that we should remove the kind of discussion tonight.