 اچ پیل سی میں ہای پرحومنس یا ہی پرشر لکوٹ کنو راک پی میں سب سہم چیز کالم تھا جس کی بیسس بھی ہم سپریشن کر رہے ہیں اور اس کالم کی کم通ہ کو ہم ڈیٹیل سے سٹریکر سکتے ہیں بیسیکل ہم نے جس ڈیس آن لائٹ کو مختلف کسم کی آنلائٹ زروعث ہوتی ہے، سپریشن کی تو آنلائٹ کی بیسس پر ہم کالم کی سلکشن کرتے ہیں حپل سی کولمز آر میڈ او سٹین لیس سٹیل انکہ یہ ہی پریشر سے فیل ہوتے ہیں تو مختلف بور سائز میں مختلف دیمیٹر میں اور مختلف لینٹ کے اندر موجود ہیں کلاسیفکیشن آف کولم دیمینٹشنز سٹنڈٹ کولم جس وقت کاملی مارکٹ میں ویلے بل ہیں اور use ہوتے ہیں وہ 4.6 میڈر دیمیٹر کے ہیں ان کی لنٹ تقیباہن 150-250 میڈر یا 15-25 سنٹی میٹر ہوتی micro bore column mbc's یہ ان کے مقابل میں لیس دیا کے ہیں یعنی دو میڈر کا کولم ہے اور اتنے باری کولم کی وجہ سے مبال فیس کی کنظمشن بھی 20 times کم ہو جاتی ہے اور انجیکشن volume بھی بہت کم ضرورت ہوتی ہے یعنی ہم کم سلوڈ کو بھی اس سینڈرائس کر سکتے ہیں small bore column کولم جن کے انٹرن دیمیٹر تقریباہن 2.5 میڈر ہو وہ small bore کولم کہلاتے ہیں مبال فیس کی کنظمشن اس میں بھی کم ہو جاتی ہے mbc's کی نسبت تھوڑی سی زیادہ یعنی 1 third کم ہو جاتی ہے fast lc column یہ اپنی لینت میں چھوٹے کولم سے 15 سنٹی میٹر کی بجائے صرف 5 سنٹی میٹر لمبا کولم ہے اور چھوٹا ہونی کی وجہ سے زیادہ ایفیشنسی شو کرتا ہے بہت جلدی ہمیں separation مل جاتی ہے ہم نے کولم کرنوٹ گرافی میں اس فکٹر کو دسکس کیا تھا کہ ہمارے molecule ایک دوسر میں جتنے زیادہ مرچ ہوں گے اتنہی زیادہ ہمیں لمبے کولم کی ضرورت ہوگی لیکن drugs کی analysis میں چونکہ ہمارا analyte normally ایک یا دو کا مکسر ہوگا تو ان کو separation کرنے کے لیے استعمال کر سکتے ہیں لیکن اگر impurities بہت زیادہ ہیں تو پھر ان کی separation کے لیے ہمیں لمبے کولم یا mbc's یعنی impurities ویسے بھی کم quantity میں ہوگی تو ہمیں لمبے کولم اور small bore کی کولم کی ضرورت ہوگی ایک اور بات ہم ابزرپ کر سکتے ہیں کہ زیادہ quantity ہمیں کولم کے ذریعے separate نہیں کرنا چاہتے کیونکہ یہ کام اگر کرنا ہو تو column chromatography یا flash chromatography ہمیں helpful ہو سکتی analysis کے لیے جہاں تھوڑی quantity کی ضرورت ہو وہاں ہم ان کولم کو استعمال کرتے ہیں جن میں silica reverse phase اور یہ reverse phase silica کا مطلب کہ uh کی بجائے اب یہاں اتھر linkage میں c18 carbon 18 کی ایک chain لگ گئی اسے end capping کہتے ہیں کہ ہم end پر جو uh موجود ہے اس کو close کر دی ہم نے اور اس uh کے نہ ہونے کی وجہ سے اب یہ molecule polar نہیں ہے non polar ہے اور non polar components سے ہی affinity رکھے گا جو ہمارے polar components ہیں یعنی drug substances جن normally polar ہیں جن میں کوئی نہ کوئی functional group استعمال ہوتا ہے جب body میں جاکی کسی function کو trigger کرنے کا کام کرتے ہیں انہیں بہت آرام سے in reverse phase columns پر سپرٹ کیا جا سکتا ہے commonly use bounded phases جیسے c8 columns market میں available ہیں c18 columns available ہیں final column or cyanide column یا ameen column اس طرح بازوقت end capping کے word کو ہم اور انداز سے بھی استعمال کرتے ہیں ایک molecule کے اندر ایک بہت سارے oh موجود ہوں گے c18 ایک بہت بڑا molecule ہے وہ سارے کے سارے oh تو cap نہیں کرے گا بہت سارے oh چھوڑ دے گا تو ان oh کی polarity کو down کرنے کے لیے یہ reverse کرنے کے لیے ہم چھوٹے molecule جس سے cyanide کے ساتھ یا ameen کے ساتھ بھی end capping کر دیتے ہیں یہ columns بھی market میں available ہیں ایک concept استعمال ہوتا ہے جس کو ہم دسکس کرنا چاہیں گے theoretical plate اس کا تعلق column کی efficiency کے ساتھ ہے theoretical plate in many separation processes is a hypothetical zone or stage in which two phases such as liquid and vapor phases of a substance establish an equilibrium with each other theoretical plate theoretically ہم بات کر رہے ہیں اس کا اپنا کوئی وجود as such کو plates کی form میں کو simple simple surfaces کی form میں کوئی چیز نہیں ہے بنائی طور پر ہم یہ سرچ کرنا چاہ رہے ہیں کہ کتنی زادہ surfaces موجود ہیں جہاں پر separation ہو رہے ہیں اور اس theoretical plates کو calculate کرنے کے لیے formula استعمال کرتے ہیں 5.54 multiply by retention time divided by peak width half peak width اس کا square اس کو سمجھنے کے لیے آپ اس peak کی form میں دیکھ سکتے ہیں یہ peak کی half width total width تو peak کی یہاں سے لے کی یہاں تک ہے تو half width w1 by 2 وہ یہ width ہے اس طرح peak ایریہ یعنی کتنے منٹ پر peak آ رہی ہے اسے ہم rt retention time بھی کہتے ہیں اور یہاں we کے ذریعے رپریزنٹ کیا گیا ہے تو number of theoretical plates معلوم کرنے کے لے 5.54 multiply by we retention time divided by half width square جتنی زادہ theoretical plates ہونگی اتنی زادہ separation بہتر ہوگی یعنی ہماری peak sharp peaks بنیں گی لیکن time کے ساتھ theoretical plates چونکہ کم ہوتی جائیں گی molecule میں end capping ہم نے کیوی تھی c18 سے c8 سے جب ہم buffers کو use کرتے ہیں یا low phk high phk solments کو use کرتے ہیں تو وہ c18 convert ہو کر دبارہ uh کی form میں آ جاتا ہے اس کا مطلب ہے کہ polarity ہماری silica کی برتی جا رہی پہلے ہماری silica بہت زیادہ انٹریکٹ نہیں کر رہی تھی molecule کے ساتھ لیکن جب وہ polar ہوتی جائے گی تو وہ ان polar substances کے ساتھ زیادہ انٹریکٹ کرے گی number of theoretical plates مختلف ہو جائیں گی اور جتنی زادہ انٹریکٹ کرے گی اتنا column میں سے sample کا نکلنا مشکل ہو جائے گا یعنی peak width برتی جائے گی زیادہ دیر تک ہمارا component column میں stay کرے گا اس کا مطلب ہے peak width میں زافہ ہوگا تو ہم number of theoretical plates اس فومولسے اگر ہماری initial column efficiency میں number of theoretical plates جتنی بھی آ رہی تھی ہم اس کو time کے ساتھ ساتھ observe کر سکتے ہیں کہ ان میں کتنی گراوت آ رہی ہے یا کتنا چینج آ رہا ہے hplc کے اندر silica based reversed face column our soluble ان کے لیے جو pH میں استعمال کرتے ہیں وہ 2 سے لیکر 8 تک 2 to 8 pH میں ہم ان columns کو use کرتے ہیں pH 2 سے نیچ ہے یعنی بہت زیادہ acidic solutions کو recommendن نہیں ہے کہ اس پر use کیا جائے کیونکہ اس سے جو ہمارے end capping کی ہوئی تھی c18 column تھا اس میں بیسی کے لیے تو either linkage ہے تو جب acid کو run کریں گے تو پھر اس میں ڈوٹ نہ شروع ہو جائیں گے اس لیے ہم pH 2 آخر limit ہے اس سے اوپر ہی دکنا چاہتے ہیں 2 to 8 تک pH کے samples یا buffers کو استعمال کرتے ہیں اس سے column containing porous graphite اگر سٹائرین بیست polymer based column ہے تو وہ کچھ اس سے زیادہ pH کو برداش کر سکتے ہیں اگر ہمیں بہت low pH پر بہت high pH پر کام کرنا ہو تو پھر ہم normal silica based column استعمال نہیں کرتے بلکہ polymer based columns کو استعمال کرتے ہیں columns کو ایک جسی condition دینے کے لیے بازوکات heating بھی column oven بھی استعمال کیا جاتا ہے کیونکہ ہم اس ملک میں کر رہے ہیں یا کسی اورجے کا کام کریں ہمیں heating کی requirement بھی ہو سکتی ہے ایک جسے temperature رکھنے کے لیے condition same رکھنے کے لیے لیکن 60 degree centigrade سے زیادہ heat کرنا رکھمنڈن نہیں ہے normally column oven 45 degree centigrade یا 40 degree centigrade پر استعمال کیا جاتا ہے